Стр. 5
Страницы:
Стр.1 |
Стр.2 |
Стр.3 |
Стр.4 |
Стр.5
подвергают бактериологическому исследованию.
2. Штамм Bac. Stearothermophilus ВКМ В-718 - подвижная
термофильная палочка, по Граму окрашивается положительно,
культивируется при t=(55+-1)°C, исключающей развитие других широко
распространенных микроорганизмов. Споры овальные, расположенные
центрально. На мясопептонном бульоне (рН(7,3+-0,1) через 24 ч
образует помутнение среды, на мясопептонном агаре (рН(7,3+-0,1) -
слабо выпуклые колонии диаметром 2-4 мм с ровным краем. Штамм
непатогенен для человека и животных.
3. Приготовление биотеста:
в ампулу с лиофилизированой культурой вносят 0,2 мл стерильной
водопроводной воды и оставляют в течение 30 мин при комнатной
температуре. 1-2 капли культуры засевают в 2 пробирки с бульоном
(МПБ. Хоттингера, питательный сухой) с 0,5% глюкозы. Суточную
бульонную культуру засевают в пробирки на скошенный агар
(Хоттингера, мясопептонный, сухой питательный). Для получения спор
культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл
стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы со скошенным
картофельно-пептонным агаром. Взвесь покачиванием флакона равномерно
распределяют по поверхности среды, инкубируют при 55°С в течение
10-12 суток в наклонном положении агаром вверх. Для создания
достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой.
На 7, 10 и 12-е сутки проверяют интенсивность спорообразования.
Достаточным количеством считают 80-90 спор в поле зрения. Культуру
смывают стерильной дистиллированной водой. С целью освобождения от
вегетативных клеток суспензию прогревают в водяной бане при
температуре 65-70°С в течение 30 мин, центрифугируют трехкратно с
частотой вращения 2000 об./мин по 15 мин, промывая осадок стерильной
дистиллированной водой после каждого центрифугирования. Отмытые
споры суспендируют в стерильной дистиллированной воде в соотношении
1:1 по объему. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре
4°С в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с
резиновыми колпачками (срок хранения - 2 года). Чистоту культуры на
всех этапах культивирования контролируют высевом на агаровые
пластинки. Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной
суспензии десятикратно разводят до 10**7 стерильной дистиллированной
водой, высевая на три агаровые пластинки по 0,1 мл ориентировочно из
10**5-10**7 (предел разведения зависит от титра полученных спор).
Посевы инкубируют в течение 48 ч, проводят подсчет выросших колоний.
Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее
арифметическое число колоний с учетом разведения исходной суспензии
и объема пробы для посева.
Пример расчетов. Предположим, что при посеве на 3 чашки Петри с
агаром суспензии в разведении 1:100000 (10**5) подсчитано 140, 110 и
134 колонии. Аналогичные высевы из разведений 10**6 привели к
образованию 12, 14 и 16 колоний; из 10**7 - 5, 3 и 7 колоний.
Вычисляем общее число колоний, а затем среднее количество колоний
для каждого разведения - 128, 14 и 5.
Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем
титры жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом
разведения, далее находим среднее арифметическое число колоний:
128 х 10 х 10**5 = 12,8 х 10**7;
14 х 10 х 10**6 = 14,0 х 10**7;
5 х 10 х 10**7 = 50,0 х 10**7.
Таким образом, титр исходной суспензии составит (12,8 + 14,0 +
+ 50,0) х 10**7 : 3 = 2,5 х 10**8 спор в 1 мл. Исходная суспензия
должна содержать не менее 2,5 х 10**7 - 2,5 х 10**8 спор в 1 мл.
Споры в количестве 5 х 10**5 - 5 х 10**6 вносят из исходной
суспензии с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329-81) в 0,02 мл
в носители (стерильные инсулиновые флакончики с ватно-марлевой
пробкой или чашечки из алюминиевой фольги, разложенные в чашки
Петри), подсушивают в термостате при температуре 37°С или в
эксикаторе над осушителем (силикогель, хлористый кальций) при
комнатной температуре в течение 24 ч.
Для определения фактической обсемененности исследуют не менее 3
биотестов от каждой группы. Во флаконы (чашечки) вносят по 1,0 мл
стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги
отмывают в широкогорлых пробирках с бусами в 10,0 мл) и встряхивают
в течение 10 мин на аппарате для встряхивания жидкостей с
последующим высевом на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл суспензии из 3
последовательных 10-кратных разведений.
4. Определение устойчивости спор тест-культур к действию
водяного насыщенного пара под избыточным давлением проводят при
температуре (120+-2)°С.
Биотесты в упаковочной бумаге помещают в стерилизационной
коробке в камеру парового стерилизатора. После набора давления в
водопроводной камере (0,11+-0,01) МПа (1,1+-0,1) кгс/кв.см) проводят
продувку парового стерилизатора (вытеснение воздуха паром из камеры
парового стерилизатора) в течение 10 мин при открытом спускном кране
и давлении в стерилизационной камере от 0,01 до 0,02 МПа (от 0,1 до
0,2 кгс/кв.см). После продувки доводят давление пара в
стерилизационной камере до (0,11+-0,01) МПа (1,1+-0,1) кгс/кв.см),
температуру (120+-2)°С, и через 5 мин (время выживания спор
тест-культуры) с момента установления давления спускают пар. Для
уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем
давления проводят максимум в течение 8 мин, спуск - в течение 3 мин.
Аналогичное исследование проводят в течение 15 мин выдержки
(время гибели спор тест-культуры). Контроль температуры осуществляют
максимальными термометрами. По окончании времени выдержки биотесты
вынимают из стерилизатора и проводят бактериологическое
исследование.
Партию биотестов считают годными для использования, если
показатели устойчивости спор тест-культуры соответствуют
вышеописанным требованиям.
5. Для определения эффективности работы стерилизатора в
обеззараженные биотесты и контрольный тест (без стерилизации)
стерильно вносят по 5 мл питательной среды, инкубируют при 55°С в
течение 7 суток при ежедневном просмотре посевов, делая высевы на
агаровые пластинки из проросших емкостей.
При использовании полусинтетической среды с индикатором
феноловым красным рост тест-культуры определяют по изменению
красного цвета среды (рН(7,7+-0,1) на желто-оранжевый (рН(6,7+-0,1)
за счет разложения глюкозы с образованием кислоты. В целях
исключения ложного отрицательного результата (при наличии роста
тест-культуры отсутствует изменение цвета питательной среды) флаконы
(пробирки) должны быть плотно закрыты стерильными резиновыми
пробками (№ 7,5; 12,5).
Отсутствие роста тест-культуры указывает на эффективность
работы стерилизатора. Рост других культур микроорганизмов относят за
счет вторичного обсеменения. При наличии роста тест-штаммов
проводится повторный контроль на удвоенном количестве биотестов.
Если и при повторной проверке тест-культуры не инактивируются,
осуществляют тщательный контроль технического состояния аппарата и
контрольно-измерительных приборов. При отсутствии роста
тест-культуры в контрольном биотесте (не подвергшемся стерилизации)
устанавливается причина (нежизнеспособность тест-культуры,
несоблюдение методики приготовления биотестов, питательных сред,
условий культивирования).
6. Для спорообразования используют:
- картофельно-пептонный агар (пептон - 5,0; мел - 1,0; агар -
25,0; картофельная вода - 1000,0 мл), рН - (7,1+-0,1). Сырой
картофель (200,0 г очищенного картофеля на 1 л водопроводной воды)
тщательно моют, очищают от кожуры и глазков, нарезают мелкими
ломтиками, заливают водопроводной водой и кипятят 30 мин после
закипания (молодой картофель употреблять нельзя). Отвар отстаивают и
фильтруют в холодном состоянии через ватно-марлевый фильтр. Доводят
объем фильтрата до первоначального. Устанавливают рН(7,1+-0,1).
Добавляют пептон и агар. Нагревают, помешивая до полного растворения
агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего добавляют
мел. Разливают по флаконам, стерилизуют при 120°С в течение 30 мин.
После стерилизации среду во флаконах скашивают;
пшеничный агар (пшеничная крупа "Артек" или "Полтавская" -
500,0; агар - 25,0; дистиллированная вода - 1000,0 мл),
рН(7,3+-0,1).
Пшеничную крупу "Артек" ("Полтавская") заливают
дистиллированной водой. Через 12 ч настой аккуратно сливают, не
выжимая, доводят до первоначального объема, добавляют агар и
растапливают на водяной бане или в автоклаве (текучим паром 1 ч).
Остывший агар выкладывают на противень и срезают осадок. Агар
растапливают на водяной бане, постоянно помешивая. Устанавливают
рН(7,3+-0,1). Разливают во флаконы. Стерилизуют текучим паром по 1 ч
в течение 3 суток. После стерилизации среду скашивают.
7. Для контроля используют бульон Хоттингера - рН(7,3+-0,1),
агар Хоттингера - рН(7,3+-0,1), питательный бульон сухой -
рН(7,1+-0,1), среду питательную для контроля стерильности сухую -
рН(7,0+-0,1), бульон из перевара кровяных сгустков,
полусинтетическую среду с индикатором феноловым красным -
рН(7,7+-0,1) (аммоний фосфорнокислый однозамещенный NH4H2PO4 - 1,0
г; магний сернокислый MgSO4 - 0,2 г; калий хлористый KCl - 0,2 г;
глюкоза - 5,0 г; феноловый красный - 0,02 г; бульон Хоттингера с
содержанием аминного азота 140-160 мг - 200,0 мл; дистиллированная
вода - 800,0 мл - рН(7,7+-0,1); компоненты смешивают и растворяют
при нагревании на водяной бане, доводят рН до (7+-0,1), разливают во
флаконы, стерилизуют при 110°С в течение 30 мин).
Приложение 5
к санитарным правилам
"Безопасность работы с
микроорганизмами III-IV
групп патогенности и
гельминтами"
Химические тесты для контроля температурных параметров режима
работы паровых стерилизаторов
------T------------T--------T------------T-------T---------------------------
¦ ¦Цвет, ¦ ¦Количе-¦ Температурные параметры,
Номер ¦Наименование¦форма ¦Нормативно- ¦ство ¦ подлежащие контролю, °С
рецеп-¦составных ¦кристал-¦техническая ¦компо- +------T------T------T------
туры ¦частей ¦лов, ¦документация¦нентов ¦110+-2¦120+-2¦126+-2¦132+-2
¦ ¦запах ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
------+------------+--------+------------+-------+------+------+------+------
1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9
------+------------+--------+------------+-------+------+------+------+------
1. Антипирин* Бесцвет- Технические 99,9+- +** - - -
Краситель: ные условия: +-0,01
фуксин кристал- ТУ 6-09-
кислый, лы или -3803-82;
феноловый белый ТУ 6-09-
красный, порошок -5170-84;
бромтимоло- без ТУ 6-09- 0,1+-
вый синий запаха -2086-77 +-0,01
или
генцианфио-
летовый
2. Резорцин, Белый 99,9+- + - - -
краситель*** или со +-0,01
слабым
желтова-
тым
оттенком
кристал-
лический
порошок
со
слабым 0,1+-
запахом +-0,01
3. Сера Желтые Технические 100,0 - + - -
элементарная кристал- условия:
лы**** ТУ
6-09-2546-77
4. Кислота Бесцвет- 95,24+- - + - -
бензойная, ные +-0,01
краситель*** игольча-
тые кри-
сталлы
или
белый 4,76+-
порошок +-0,01
5. Бензамид Бесцвет- Технические 100,0 - - + -
ные кри- условия:
сталлы ТУ
6-09-14-21-
-04-81
6. Сукцинамид Бесцвет- Технические 100,0 - - + -
ные кри- условия:
сталлы в ТУ
виде 6-09-08-889-
пластин- -83
чатых
игл
7. Кислота Бесцвет- Государст- 99,9+- - + - -
бензойная, ные венный +-0,01
краситель*** игольча- стандарт:
тые кри- ГОСТ
сталлы 6413-77;
или ГОСТ
белый 10521-78 0,1+-
порошок +-0,01
8. D(+) Бесцвет- Технические 99,9+- - - - +
Манноза, ные кри- условия: +-0,01
краситель*** сталлы в ТУ
виде 6-09-07-666-
ромбиче- -76
ческих 0,1+-
призм +-0,01
9. Никотинамид, Белый Технические 99,9+- - - - +
краситель*** мелко- условия: +-0,01
кристал- ТУ
лический 6-09-08-852-
порошок -82
со 0,1+-
слабым +-0,01
запахом
10. Мочевина, Бесцвет- Государст- 95,24+- - - - +
краситель*** ные кри- венный +-0,01
сталлы стандарт:
ГОСТ 6691-77 4,76+-
+-0,01
-----------------------------------------------------------------------------
Примечание:
*Относится к сильнодействующим лекарственным средствам,
применение и хранение которых должно проводиться с
предосторожностью: хранение в закрытых шкафах в сухом помещении.
**+ Температурный параметр, для контроля используется
химическое соединение.
***Используют любой из красителей, перечисленных в рецептуре 1.
****При использовании серы в качестве химического теста
добавление красителя нецелесообразно, так как при плавлении вещества
не происходит его смешение с красителем.
Химические тесты для контроля температурных параметров режимов
работы воздушных стерилизаторов*
---T------------T--------T------------T-------T---------------------
¦ ¦Цвет, ¦ ¦ ¦Температурные
¦Наименование¦форма ¦Нормативно- ¦Количе-¦параметры, подлежащие
№ ¦химического ¦кристал-¦техническая ¦ство ¦контролю, °С
п/п¦соединения ¦лов, ¦документация¦компо- +----------T----------
¦ ¦запах ¦ ¦нента,г¦ 160-10°С ¦ 180-10°С
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 160+2°С ¦ 180+2°С
---+------------+--------+------------+-------+----------+----------
1. Левомице- Белый 100,0 +*** -
тин** или
белый со
слабым
желтова-
то-зеле-
новатым
оттенком
кристал-
лический
порошок
без
запаха
2. Кислота Порошок Государст- 100,0 - +
винная белого венный
цвета стандарт:
или ГОСТ
прозрач- 5817-77;
ные бес- ГОСТ
цветные 21205-83
кристал-
лы
3. Гидрохинон Бесцвет- Государст- 100,0 - +
ные и венный
светло- стандарт:
серые ГОСТ
сереб- 19627-74
ристые
кристал-
лы
4. Тиомочевина Блестя- Государст- 100,0 - +
щие венный
бесцвет- стандарт:
ные ГОСТ 6344-73
кристал-
лы
--------------------------------------------------------------------
Примечания:
*В состав химических тестов для контроля работы воздушных
стерилизаторов краситель не добавляют, так как указанные химические
соединения изменяют свой цвет при достижении температуры плавления.
**Относится к сильнодействующим лекарственным средствам,
применение и хранение которых должно проводиться с
предосторожностью: хранение в закрытых шкафах в сухом помещении.
***+ Температурный параметр, для контроля используют химическое
соединение.
Химические индикаторы в паровом стерилизаторе размещают в
каждой обеззараживаемой емкости и два - в самой камере, в воздушных
стерилизаторах - от 5 до 15 в зависимости от емкости камеры. Вместо
химических тестов могут быть использованы термовременные индикаторы
(ТВИ), контролирующие температуру и время стерилизации (ТВИ-160 и
ИС-180) при воздушной стерилизации, а при паровой стерилизации
(ТВИ-120 и ИС-132) и наличие пара. Индикаторы представляют собой
полосы длиной 2-3 см, отрываемые от бумажной ленты с нанесенным на
нее индикаторным слоем, цвет которого необратимо меняется только при
соблюдении режимов стерилизации.
Страницы:
Стр.1 |
Стр.2 |
Стр.3 |
Стр.4 |
Стр.5
|
